Técnicas de Edición de Acidos Nucléicos - Ratón biparental obtenido con CRISPR

Descendencia bipaternal adulta generada mediante modificación directa de genes impresos en mamíferos

Tipo de edición: 

En el estudio la modificación genética se realiza ex vivo en células madre embrionarias haploides androgénicas, que se modifican en laboratorio y luego se inyectan en oocitos mediante ICSI. Los embriones modificados se transfieren in vivo al útero de madres de sustitución para su desarrollo. Las modificaciones genéticas se aplican a células somáticas como los fibroblastos

Dirigido hacia:

Genes improntados: Igf2-H19, Dlk1-Dio3, y Rasgrf1

Dirigido por:

• Técnica CRISPR/Cas9 y nucleasas de dedos de zinc (ZFN) para la modificación genética
• Vector adenoviral (Ad5-Cas9) y vector rAAV también fueron utilizados

Órgano a tratar:

Riñones y pulmones

• Células diana: Células madre embrionarias haploides androgénicas (ahESC) y fibroblastos somáticos

Vía de administración:

Parenteral (inyección intracitoplasmática de esperma (ICSI) y transferencia de embriones al útero de madres de sustitución)

Resultados a corto plazo:

A los 7 días después de la inyección, se observan diferencias en el desarrollo de los embriones bipaternos, pero con una tasa de mortalidad temprana debido a deficiencias en la succión y problemas respiratorios

Resultados a mediano plazo:

Después de 80 días, se observó una mejoría en el desarrollo de los ratones bipaternos con 18 y 20 modificaciones de impronta, mejorando su viabilidad, pero aún con limitaciones, como deficiencias en la capacidad de succión

Resultados a largo plazo:

Los ratones bipaternos con 20 modificaciones de impronta mostraron una supervivencia más alta, pero la tasa de mortalidad persistió debido a defectos en la impronta genética que afectaron su desarrollo completo y reproducción natural

Imagen: Clonación de crías bipaternas a partir de células somáticas de ratones bipaternos. (A) Comparación transcriptómica de células somáticas derivadas del cerebro de ratones bipaternos de 6 semanas de edad y ratones WT de la misma edad. (B) Esquema que muestra el proceso de obtención de fibroblastos de la punta de la cola de ratones bipaternos para la clonación de células somáticas. (C) Clon de un ratón bipaterno 20KO y su placenta. (D) Embriones bipaternos reconstruidos con esperma de ratones 20KO desarrollados hasta la etapa más avanzada.

Obtenido de: https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(25)00005-0#

Terapia con Stem Cells en la Hipertensión

Análisis comparativo sobre el efecto antiinflamatorio/inmune de la terapia con células madre mesenquimales para el tratamiento de la hipertensión arterial pulmonar

• Tipo de Stem Cells: Células madre mesenquimales (MSCs) derivadas de tres fuentes: Tejido adiposo (AD-MSC), Médula ósea (BM-MSC), Sangre del cordón umbilical (UCB-MSC)(1.)

• Método de obtención: AD-MSC y UCB-MSC fueron adquiridas comercialmente de Medipost (Corea del Sur), mientras que las BM-MSC se obtuvieron de Cefobio (Corea del Sur). Todas fueron cultivadas y caracterizadas por expresión de CD44 y CD90 (positivos) y ausencia de CD34 (negativo), confirmando su pureza como MSCs humanas (1).

• Vía de administración: Inyección intravenosa en la vena de la cola (IV) (1).

• Resultados a corto plazo: A los pocos días del tratamiento, se observó injerto exitoso de las MSCs (mayor en las UCB-MSCs) y una disminución de marcadores inflamatorios (TNF-α, TGF-β) y células inmunes infiltradas (macrófagos M1/M2, células T y B) (1).

• Resultados a mediano plazo: A las 2 semanas post-tratamiento, se evidenció mejoría en la función ventricular derecha (↓ presión TR, ↑ TAPSE, ↑ FAC), siendo más notable con UCB-MSCs, que lograron una mayor recuperación hemodinámica frente a AD y BM-MSCs (1).

• Resultados a largo plazo: Reducción del grosor de la pared arterial, fibrosis perivascular y proliferación celular en el pulmón. Además, hubo modulación positiva de las vías clásicas de la hipertensión pulmonar (óxido nítrico, prostaciclina y endotelina), siendo UCB-MSCs las más efectivas en revertir estos cambios (1).

Imagen: Análisis histológicos e inmunohistoquímicos de la remodelación vascular. (a-c) Representativo, Imágenes obtenidas de H&E

Obtenido de: https://www.nature.com/articles/s41598-021-81244-1

ADN recombinante artificial y en la naturaleza

 ADN RECOMBINANTE EN LA NATURALEZA

¿Generado aleatoriamente y seleccionado funcionalmente? La naturaleza de la recombinación de enterovirus

Este estudio analiza la recombinación genética en enterovirus como un mecanismo evolutivo natural, sin intervención humana. Utilizando un sistema in vitro (CRE-REP) y coinfección con poliovirus tipo 1 y 3, los autores buscaron entender si la identidad de secuencia o la estructura del ARN determinan los sitios de recombinación. Encontraron que estos eventos ocurren de forma aleatoria, y que la selección posterior favorece solo los genomas funcionales. A través de secuenciación masiva se identificaron recombinantes precisos e imprecisos distribuidos por todo el genoma. El crossing over en estos virus es un proceso replicativo espontáneo seguido de una estricta selección por viabilidad (1). 

Figura 1: Representación esquemática de los ensayos CRE-REP

Obtenido de: https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC9144335/

 ADN RECOMBINANTE ARTIFICIAL

IL-15 citotópica (cito-) como nueva inmunoterapia para el cáncer de próstata: producción recombinante en Escherichia coli y purificación

• Tema: IL-15 citotópica (cito-) como nueva inmunoterapia para el cáncer de próstata

• Objetivo: Optimizar la producción y purificación de IL-15 humana modificada para facilitar su modificación citotópica y evaluar su eficacia como tratamiento contra tumores de próstata en modelos murinos

• Gen o secuencia a clonar: Gen humano IL-15 modificado, que codifica los aminoácidos 49–162

• Enzimas de restricción: NdeI y HindIII

• Enzimas ligasa: No se menciona el uso explícito de una enzima ligasa en el artículo, pero en un protocolo normal de clonación molecular, T4 DNA ligasa sería la utilizada

• Vector: pET30a

• Célula receptora: Escherichia coli BL21 star (DE3) - Procariota

• Mecanismo de transferencia o inserción del gen: Transformación en estrella E. coli BL21 mediante choque térmico

• Métodos de identificación de clones: Los clones positivos se seleccionaron mediante resistencia a kanamicina y posteriormente se cultivaron a 37 °C con agitación en medio terrific broth. También se realizó SDS-PAGE para verificar tamaño y pureza de la proteína (~18 kDa), western blot con anticuerpos anti-IL-15 y anti-PTL3146 y ensayo funcional de proliferación celular con células CTLL-2, confirmando la actividad biológica del IL-15 (2).

Figura 2: Representación esquemática de la IL-15 humana modificada, el péptido citotópico PTL3146 y la IL-15 citotópicamente modificada final (cito-IL-15).

Obtenido de: https://www.frontiersin.org/journals/molecular-biosciences/articles/10.3389/fmolb.2021.755764/full