Técnicas de Edición de Acidos Nucléicos - Ratón biparental obtenido con CRISPR

Descendencia bipaternal adulta generada mediante modificación directa de genes impresos en mamíferos

Tipo de edición: 

En el estudio la modificación genética se realiza ex vivo en células madre embrionarias haploides androgénicas, que se modifican en laboratorio y luego se inyectan en oocitos mediante ICSI. Los embriones modificados se transfieren in vivo al útero de madres de sustitución para su desarrollo. Las modificaciones genéticas se aplican a células somáticas como los fibroblastos

Dirigido hacia:

Genes improntados: Igf2-H19, Dlk1-Dio3, y Rasgrf1

Dirigido por:

• Técnica CRISPR/Cas9 y nucleasas de dedos de zinc (ZFN) para la modificación genética
• Vector adenoviral (Ad5-Cas9) y vector rAAV también fueron utilizados

Órgano a tratar:

Riñones y pulmones

• Células diana: Células madre embrionarias haploides androgénicas (ahESC) y fibroblastos somáticos

Vía de administración:

Parenteral (inyección intracitoplasmática de esperma (ICSI) y transferencia de embriones al útero de madres de sustitución)

Resultados a corto plazo:

A los 7 días después de la inyección, se observan diferencias en el desarrollo de los embriones bipaternos, pero con una tasa de mortalidad temprana debido a deficiencias en la succión y problemas respiratorios

Resultados a mediano plazo:

Después de 80 días, se observó una mejoría en el desarrollo de los ratones bipaternos con 18 y 20 modificaciones de impronta, mejorando su viabilidad, pero aún con limitaciones, como deficiencias en la capacidad de succión

Resultados a largo plazo:

Los ratones bipaternos con 20 modificaciones de impronta mostraron una supervivencia más alta, pero la tasa de mortalidad persistió debido a defectos en la impronta genética que afectaron su desarrollo completo y reproducción natural

Imagen: Clonación de crías bipaternas a partir de células somáticas de ratones bipaternos. (A) Comparación transcriptómica de células somáticas derivadas del cerebro de ratones bipaternos de 6 semanas de edad y ratones WT de la misma edad. (B) Esquema que muestra el proceso de obtención de fibroblastos de la punta de la cola de ratones bipaternos para la clonación de células somáticas. (C) Clon de un ratón bipaterno 20KO y su placenta. (D) Embriones bipaternos reconstruidos con esperma de ratones 20KO desarrollados hasta la etapa más avanzada.

Obtenido de: https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(25)00005-0#

Terapia con Stem Cells en la Hipertensión

Análisis comparativo sobre el efecto antiinflamatorio/inmune de la terapia con células madre mesenquimales para el tratamiento de la hipertensión arterial pulmonar

• Tipo de Stem Cells: Células madre mesenquimales (MSCs) derivadas de tres fuentes: Tejido adiposo (AD-MSC), Médula ósea (BM-MSC), Sangre del cordón umbilical (UCB-MSC)(1.)

• Método de obtención: AD-MSC y UCB-MSC fueron adquiridas comercialmente de Medipost (Corea del Sur), mientras que las BM-MSC se obtuvieron de Cefobio (Corea del Sur). Todas fueron cultivadas y caracterizadas por expresión de CD44 y CD90 (positivos) y ausencia de CD34 (negativo), confirmando su pureza como MSCs humanas (1).

• Vía de administración: Inyección intravenosa en la vena de la cola (IV) (1).

• Resultados a corto plazo: A los pocos días del tratamiento, se observó injerto exitoso de las MSCs (mayor en las UCB-MSCs) y una disminución de marcadores inflamatorios (TNF-α, TGF-β) y células inmunes infiltradas (macrófagos M1/M2, células T y B) (1).

• Resultados a mediano plazo: A las 2 semanas post-tratamiento, se evidenció mejoría en la función ventricular derecha (↓ presión TR, ↑ TAPSE, ↑ FAC), siendo más notable con UCB-MSCs, que lograron una mayor recuperación hemodinámica frente a AD y BM-MSCs (1).

• Resultados a largo plazo: Reducción del grosor de la pared arterial, fibrosis perivascular y proliferación celular en el pulmón. Además, hubo modulación positiva de las vías clásicas de la hipertensión pulmonar (óxido nítrico, prostaciclina y endotelina), siendo UCB-MSCs las más efectivas en revertir estos cambios (1).

Imagen: Análisis histológicos e inmunohistoquímicos de la remodelación vascular. (a-c) Representativo, Imágenes obtenidas de H&E

Obtenido de: https://www.nature.com/articles/s41598-021-81244-1

ADN recombinante artificial y en la naturaleza

 ADN RECOMBINANTE EN LA NATURALEZA

¿Generado aleatoriamente y seleccionado funcionalmente? La naturaleza de la recombinación de enterovirus

Este estudio analiza la recombinación genética en enterovirus como un mecanismo evolutivo natural, sin intervención humana. Utilizando un sistema in vitro (CRE-REP) y coinfección con poliovirus tipo 1 y 3, los autores buscaron entender si la identidad de secuencia o la estructura del ARN determinan los sitios de recombinación. Encontraron que estos eventos ocurren de forma aleatoria, y que la selección posterior favorece solo los genomas funcionales. A través de secuenciación masiva se identificaron recombinantes precisos e imprecisos distribuidos por todo el genoma. El crossing over en estos virus es un proceso replicativo espontáneo seguido de una estricta selección por viabilidad (1). 

Figura 1: Representación esquemática de los ensayos CRE-REP

Obtenido de: https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC9144335/

 ADN RECOMBINANTE ARTIFICIAL

IL-15 citotópica (cito-) como nueva inmunoterapia para el cáncer de próstata: producción recombinante en Escherichia coli y purificación

• Tema: IL-15 citotópica (cito-) como nueva inmunoterapia para el cáncer de próstata

• Objetivo: Optimizar la producción y purificación de IL-15 humana modificada para facilitar su modificación citotópica y evaluar su eficacia como tratamiento contra tumores de próstata en modelos murinos

• Gen o secuencia a clonar: Gen humano IL-15 modificado, que codifica los aminoácidos 49–162

• Enzimas de restricción: NdeI y HindIII

• Enzimas ligasa: No se menciona el uso explícito de una enzima ligasa en el artículo, pero en un protocolo normal de clonación molecular, T4 DNA ligasa sería la utilizada

• Vector: pET30a

• Célula receptora: Escherichia coli BL21 star (DE3) - Procariota

• Mecanismo de transferencia o inserción del gen: Transformación en estrella E. coli BL21 mediante choque térmico

• Métodos de identificación de clones: Los clones positivos se seleccionaron mediante resistencia a kanamicina y posteriormente se cultivaron a 37 °C con agitación en medio terrific broth. También se realizó SDS-PAGE para verificar tamaño y pureza de la proteína (~18 kDa), western blot con anticuerpos anti-IL-15 y anti-PTL3146 y ensayo funcional de proliferación celular con células CTLL-2, confirmando la actividad biológica del IL-15 (2).

Figura 2: Representación esquemática de la IL-15 humana modificada, el péptido citotópico PTL3146 y la IL-15 citotópicamente modificada final (cito-IL-15).

Obtenido de: https://www.frontiersin.org/journals/molecular-biosciences/articles/10.3389/fmolb.2021.755764/full

Técnica de hibridación para Neoplasias mieloides

 Leucemia mieloide crónica

En el diagnóstico de la leucemia mieloide crónica (LMC), se utiliza la técnica de hibridación in situ fluorescente (FISH) como una herramienta eficaz para detectar la translocación t(9;22)(q34;q11), responsable de la formación del gen de fusión BCR::ABL1, característico de esta neoplasia. Esta técnica emplea sondas específicas para los genes BCR y ABL1, permitiendo la identificación del cromosoma Filadelfia tanto en médula ósea como en sangre periférica. FISH es útil en casos donde el cariotipo no detecta alteraciones o en pacientes con variantes moleculares. Además, se complementa con estudios de PCR para cuantificar la expresión del gen BCR::ABL1, lo cual es fundamental para el seguimiento y evaluación de la respuesta al tratamiento con inhibidores de tirosina-quinasa (1).

Tabla: Categorías de respuesta importantes en la leucemia mieloide crónica

Obtenido de: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/ajh.26642

Video obtenido de: https://www.youtube.com/watch?v=NB_gt1TY-CA

Prueba PCR para Toxoplamosis congénita

La toxoplasmosis congénita representa un importante problema de salud pública en varios países, y su diagnóstico presenta múltiples desafíos. Entre las herramientas más eficaces para su confirmación destaca la Reacción en Cadena de la Polimerasa en Tiempo Real (qPCR), una técnica molecular que permite detectar el ADN del Toxoplasma gondii, agente causal de la enfermedad.

• Tema: PCR en tiempo real para el diagnóstico de la toxoplasmosis congénita
• Objetivo: Evaluar el uso de la PCR en tiempo real como herramienta diagnóstica para detectar Toxoplasma gondii en muestras biológicas.
• Tipo de muestras biológicas: El estudio evaluó diferentes tipos de muestras provenientes de mujeres embarazadas y sus recién nacidos, como líquido amniótico, sangre periférica materna y del RN y placenta.
• Extracción del ácido nucléico: Se extrajo ADN genómico a partir de las diferentes muestras biológicas utilizando el kit QIAamp DNA Blood Mini Kit. La concentración del ADN fue medida mediante espectrofotometría UV a 260 nm con el equipo Nanodrop 1000.
• Tipo de PCR:  PCR en tiempo real (qPCR) con el sistema TaqMan, no es una PCR patentada, ya que emplea métodos comerciales disponibles, pero sí utiliza una sonda específica fluorescente que incrementa la sensibilidad del análisis.
• Genes amplificados: El blanco molecular fue la secuencia REP-529 del T. gondii, una región altamente repetitiva con 529 pb, lo que favorece su detección incluso en muestras con baja carga parasitaria.
• Pasos de la PCR:

1. Extracción del ADN: Se extrajo ADN genómico con el QIAGEN.
2. Cuantificación del ADN: Espectrofotómetro UV (Nanodrop 1000) a 260 nm.
3. Preparación de la reacción: Iniciadores específicos (primers 270F y 318R) y sonda TaqMan para la secuencia REP-529. Reacción en un volumen final de 25 μL.
4. Condiciones del termociclador: 2 min a 50 °C, 10 min a 95 °C, 40 ciclos de: 15 s a 95 °C, 1 min a 60 °C.

• Tipo de resultados: Los resultados fueron cuantitativos, expresados como Unidades Internacionales (UI) o copias por mililitro (copias/mL). Se estableció una curva estándar con diluciones seriadas de ADN de T. gondii, de 10⁶ a 1 parásito/mL. La eficiencia del PCR fue superior al 92% y el coeficiente de correlación fue ≥0.99. Una muestra fue clasificada como indetectable si el umbral de ciclo (CT) era >38. Se usó amplificación del gen humano RNaseP como control interno para verificar calidad del ADN y ausencia de inhibidores.
• Muestra más efectiva: Líquido amniótico 

Tabla: Descripción de casos de toxoplasmosis congénita y aquellos con muestra de PCR positiva.

Obtenido de: https://www.scielo.br/j/bjid/a/jgszkpKNqJt6dVdrS8F55pP/?lang=en

Técnica de Secuenciación para Infarto agudo de miocardio

Estudio del transcriptoma de todo el genoma mediante secuenciación profunda de ARN para el infarto de miocardio y la calcificación de la arteria coronaria

Este estudio utilizó secuenciación profunda de ARN en sangre para identificar genes relacionados con infarto agudo de miocardio (IAM) temprano y calcificación coronaria (CAC). Se encontraron 68 genes codificantes y 2 lincRNAs diferencialmente expresados en casos de IAM, y solo 3 genes codificantes y 1 lincRNA en CAC. Uno de los genes más importantes fue APOD, involucrado en el metabolismo de lipoproteínas y que se encontró más bajo en ambos grupos, este gen podría ser clave en el desarrollo de enfermedades del corazón. También se vieron alteraciones en genes relacionados con el sistema inmune y el metabolismo de las grasas (1).

Figura 1: Diagrama de flujo de mapeo de secuenciación, cuantificación y análisis de expresión de datos de RNA-Seq para identificar firmas de expresión codificantes y no codificantes asociadas con MI y CAC.

Obtenido de: https://link.springer.com/article/10.1186/s12920-020-00838-2/figures/1

Alteración de la Epigenética en la Neumonía

Susceptibilidad epigenética a infecciones virales respiratorias graves y sus implicaciones terapéuticas

Este artículo explica cómo los virus respiratorios, como el SARS-CoV-2 y el H5N1 pueden causar neumonía grave al alterar mecanismos epigenéticos del cuerpo, como la metilación del ADN y los cambios en histonas. Estas alteraciones afectan genes importantes como ACE2, PCBP2, SMAD9L, CFHR1 y DDX58, que están relacionados con la inflamación y la defensa antiviral. Estos cambios pueden empeorar la inflamación y el daño pulmonar. También se analizan fármacos como tocilizumab, estatinas, curcumina y metformina, que podrían ayudar a controlar estas alteraciones y mejorar el tratamiento (1).

Figura 1: Alteraciones epigenéticas virus-huésped

Obtenido de: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0007091220305638